УДК 601.2:602.3

 

Для длительного хранения дрожжей, представителей рода Zygosaccharomyces, в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов применяются методы субкультивирования, лиофилизации и криоконсервации. Культуры сохраняют при этом жизнеспособность и морфолого-культуральные свойства.

 

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ХРАНЕНИЯ ПРОМЫШЛЕННО-ЦЕННЫХ ДРОЖЖЕЙ РОДА ZYGOSACCHAROMYCES

 

Институт микробиологии НАН Беларуси, г. Минск, Республика Беларусь

 

А.В. Кантерова, научный сотрудник лаборатории «Коллекция микроорганизмов»;

И.С. Важинская, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории «Коллекция микроорганизмов»;

Г.И. Новик, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией «Коллекция микроорганизмов»

 

УО Могилевский государственный университет продовольствия, г. Могилёв, Республика Беларусь

 

Е.А. Цед, кандидат технических наук, доцент кафедры технологии пищевых производств

 

Несмотря на конкуренцию безалкогольных напитков на рынке сбыта, хлебный квас – напиток, приготовленный на натуральной основе, с каждым годом приобретает все большую популярность у потребителей. Обладая отличными вкусовыми качествами, квас содержит также целый ряд биологически ценных веществ, положительно влияющих на обменные процессы организма человека.

В Могилевском государственном университете продовольствия на кафедре «Технология пищевых производств» из природных консорциумов микроорганизмов-симбионтов была выделена новая раса дрожжей, изучены их культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства. В результате идентификации дрожжи отнесены к виду Zygosaccharomyces fermentati Naganishi 1928. Авторы предложили использовать их в качестве источника брожения при сбраживании квасного сусла, поскольку дрожжи утилизируют широкий спектр углеводов. В результате, применение дрожжей Z. fermentati расы CD в качестве монозакваски для сбраживания квасного сусла в процессе производства хлебного кваса,  позволило получить продукт высокого качества. Таким образом, авторы вносят вклад в решение проблемы импортозамещения сбраживающих компонентов, закупаемых в настоящее время в Российской Федерации [1, 2].

Культура Z. fermentati  CD  депонирована в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (БКМ). Основной задачей БКМ является обеспечение длительного хранения промышленно-ценных штаммов без потери присущих им свойств. Хранятся дрожжи Z. fermentati CD тремя методами – субкультивирования (пересевы через 3 месяца на агаровое пивное сусло), лиофилизации и криоконсервации.

Культуру дрожжей перед  лиофилизацией выращивали 72 часа на сусловом агаре и смывали таким объемом  протекторной среды, который обеспечивал максимально возможную концентрацию микроорганизмов в суспензии (1-2 мл протекторной среды для достижения КОЕ 1·109 в мл). В стеклянные ампулы объемом 2 мл вносили по 0,1 мл суспензии. Дрожжи высушивали на установке Modulyo 4K фирмы Edwards в два этапа: при температуре -55°С и глубине вакуума 8·10-2 mbar – 4 часа, затем при комнатной температуре и глубине вакуума 8·10-2 mbar – 18 часов. Ампулы с лиофилизированной культурой хранили при +4°С.

Репарацию дрожжей проводили в течение  1 часа стерильной водопроводной  водой при комнатной температуре [3].

Перед  криоконсервацией дрожжи  выращивали на сусловом агаре до  стационарной фазы роста (70-72 ч). Клетки смывали криопротектором (глицерин, 10% об.; сахароза, 10%), помещали в криопробирки марки Эппендорф по 1,0 мл и выдерживали при температуре +4оС в течение 45 минут. Затем пробирки  вставляли в специальные  контейнеры и замораживали в морозильной камере   для длительного хранения при -70°С. Отогрев дрожжей после криоконсервации проводили на водяной бане при 37оС, не допуская их перегрева [4].

Количество жизнеспособных  клеток  определяли до лиофилизации и криоконсервации, через 1 сутки и через 2 года хранения по общепринятым методикам [5]. Результаты определения жизнеспособности дрожжей представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Показатели сохранения жизнеспособности штамма дрожжей Z. fermentati CD после хранения в лиофилизированном состоянии и при -700С

Метод хранения

Протекторная среда

КОЕ/мл,

перед помещением на хранение

КОЕ/мл,

после 1 суток хранения

КОЕ/мл,

после 2 лет хранения

Криоконсервация

глицерол, 10% об.

7,8·108

5,5·108

5,2·108

сахароза, 10%

1,3·109

8,6·108

7,9·108

Лиофилизация

сахарозо-желатиновый агар

8,9·108

6,8·108

6,6·108

 

Из результатов, представленных в табл. 1, можно сделать вывод, что показатели жизнеспособности дрожжей после 2 лет хранения в лиофилизированном состоянии и при -700С лишь незначительно ниже исходных (перед помещением на хранение), что свидетельствуют о достаточно высокой устойчивости штамма Z. fermentati CD к стрессовым ситуациям, связанным с лиофилизацией и глубоким замораживанием. Данные методы будут использованы в БКМ для длительной консервации дрожжей рода Zygosaccharomyces.

Морфологию клеток дрожжей штамма Z. fermentati CD, восстановленных после хранения культуры в лиофилизированном и замороженном состоянии в течение 2-х лет, изучали после репарации культуры через 3 суток культивирования на сусловом агаре. Результаты представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Морфологические признаки  дрожжей Z. fermentati CD после хранения в течение 2-х лет различными методами

 

Характеристика дрожжей

 

Метод хранения

Субкультивирование на сусловом агаре

Криоконсервация с  глицеролом (10% об.)

Криоконсервация с сахарозой (10%)

Лиофилизация с сахарозо-желатиновым агаром

Цвет штрих- культуры

белый

белый

белый

белый

Наличие псевдомицелия

псевдомицелий

образуется

псевдомицелий образуется

псевдомицелий образуется

псевдомицелий образуется

Форма клеток через 3 суток роста

круглые, реже овальные, изредка – цилиндрические

круглые или слегка овальные, значительно реже – цилиндрические

круглые или слегка овальные, изредка – цилиндрические

круглые или  овальные, изредка – цилиндрические

Средний размер клеток (мкм)

(2,0-7,0)×(3,0-8,0)

(2,5-7,0)×(3,0-7,5)

(2,2-7,0)×(3,2-7,5)

(2,0-6,5)×(3,5-7,5)

Количество аскоспор в асках

от 1 до 4

от 1 до 4

от 1 до 4

от 1 до 4

 

Результаты, представленные в табл. 2, показывают, что морфология дрожжей практически не изменяется в зависимости от метода длительного хранения, несмотря на условия стрессового воздействия при лиофилизации и криоконсервации.

Для физиолого-биохимической характеристики проверялась способность дрожжей штамма Z. fermentati CD сбраживать и ассимилировать ряд сахаров, что является наиболее важным показателем для данного таксона микроорганизма. Результаты представлены в табл. 3.

 

Таблица 3. Степень сбраживания и ассимиляции сахаров дрожжами  Z. fermentati CD после 2-х лет хранения различными методами*

Способность сбраживать

Субстрат

Метод хранения

Субкультивирование

Криоконсервация с глицеролом (10% об.)

Криоконсервация с сахарозой (10%)

Лиофилизация с сахарозо-желатиновым агаром

Глюкоза

++++

++++

++++

++++

Сахароза

++++

++++

++++

++++

Мальтоза

+++

+++

+++

+++

Раффиноза

+++

+++

+++

+++

Способность ассимилировать

Глюкоза

++++

++++

++++

++++

Галактоза

++++

++++

++++

++++

L-сорбоза

++++

++++

++++

++++

Мальтоза

++++

++++

++++

++++

Целлобиоза

+++

+++

+++

+++

Трегалоза

++++

++++

++++

++++

Раффиноза

++++

++++

++++

++++

Мелецитоза

+++

+++

+++

+++

Инулин

+++

+++

+++

+++

Этанол

++++

++++

++++

++++

Сахароза

++++

++++

++++

++++

Маннит

++++

++++

++++

++++

*«++++» - максимальная степень сбраживания и ассимиляции, «+++» - высокая степень сбраживания и ассимиляции.

 

Результаты тестов показали, что после хранения в лиофилизированном состоянии и при -70°С в течение 2-х лет по способности сбраживать и ассимилировать сахара дрожжи  практически не отличались от поддерживаемых методом периодических пересевов, все образцы имели сходные характеристики.

Методы лиофилизации и криоконсервации чаще всего используются в большинстве коллекций микроорганизмов для длительного хранения фондов культур. Эти методы достаточно надежны и просты в реализации, однако наряду со специальным оборудованием для них требуется предварительно провести длительную и трудоемкую работу по оптимизации возраста культур перед консервацией, подбора протекторных сред, установления параметров проведения замораживания и репарации и т. д. Вся эта работа в БКМ проводится, учитывая таксономическую принадлежность культур. Таким образом, по результатам, представленным в данной работе, можно сделать вывод, что режимы долгосрочного хранения дрожжей Z. fermentati CD в лиофилизированном состоянии и при -70°С  подобраны корректно, и это дает гарантию длительного сохранения этой промышленно-ценной культуры с целью использования в качестве монозакваски для сбраживания квасного сусла при производстве кваса.

 

ЛИТЕРАТУРА

 

1.            Королева, Л.М. Идентификация микробного состава поликультуры рисового гриба как основы получения ферментированных безалкогольных напитков / Л.М. Королева и др. // Пиво и напитки. – 2007. № 2.– С. 40-42.

2.            Цед, Е.А. Применение нового вида дрожжей Zygosaccharomyces fermentati Naganishi в квасном производстве / Е.А. Цед и др. // Пищевая промышленность: наука и технологии. – 2010. – № 4(10) – С. 52-58.

3.            Кантерова, А.В. Сохранение жизнеспособности и свойств дрожжей Saccharomyces cerevisiae методом лиофилизации / А.В. Кантерова, И.И.Алешкевич, Г.И.Новик // «Актуальные аспекты современной микробиологии».VI Молодежная школа-конференция с международным участием (Москва, 25 — 27 октября 2010 г.). С. 30-32.

4.            Кантерова, А.В. Жизнеспособность дрожжей рода Saccharomyces после криоконсервации / А.В. Кантерова, Г.И.Новик // «Актуальные аспекты современной микробиологии».V Молодежная школа-конференция с международным участием (Москва, 26 — 27 октября 2009 г.). С. 29-30.

5.            Луста, К.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов / К.А. Луста, Б.А. Фихте // Научный центр биологических исследований АН СССР в Пущине, 1990. 186 с.

Рукопись статьи поступила в редакцию 23.10.2013

 

A.V. Kanterova, I.S. Vazhynskaya, E.A. Tsed, G.I. Novik

 

OPTIMIZATION OF MAINTENANCE METHODS FOR INDUSTRIALS VALUABLE YEAST OF GENUS ZYGOSACCHAROMYCES

 

Sub culturing, freeze-drying and cryoconservation techniques are practiced at Belarussian collection of non-pathogenic microorganisms for long-term preservation of yeast belonging to genus Zygosaccharomyces. The cultures retain viability and inherent morphological-cultural characteristics.